快速灵敏的甘蔗线条花叶病毒免疫学检测体系的建立

 甘蔗花叶病广泛存在于我国甘蔗种植区,严重影响甘蔗产业的高质量发展。近年来甘蔗线条花叶病毒在蔗区肆虐,尽管针对其的血清学检测技术已经建立,但是快速、准确、高通量的检测方法亟待发掘。本研究制备了^SCSMVCP的抗血清,特异性高,与引起甘蔗花叶病的另两种病原 (高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒) 间没有血清学交叉反应。基于该多克隆抗体,建立了直接抗原包被的ELISA、斑点杂交、Western blot和基于多抗的免疫试纸条检测技术。开发的免疫试纸条检测技术能快速、准确、高通量应用于田间病毒鉴定。本文提供了基于血清学的快速、准确、高通量,且便捷的甘蔗线条花叶病毒检测技术,有助于我国蔗区甘蔗花叶病的监测与防控。     

刺萼龙葵种子中适宜内参基因的筛选

入侵杂草刺萼龙葵Solanum rostratum Dunal传播扩散的主要载体是种子,研究其种子休眠萌发基因的激素调控对于其防除具有重要意义,而选择合适的内参基因可以提高相关基因表达分析的准确性。本研究以赤霉素、脱落酸和水处理的刺萼龙葵种子为材料,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4种软件对15个候选内参基因进行表达稳定性评价,并通过检测ABI5(abscisic acid-insensitive 5)的表达验证所筛选的内参基因的适用性。结果表明,对于赤霉素、脱落酸和水处理过的种子,最稳定的内参基因分别为eIF(eukaryotic initiation factor)、SAND(SAND protein family)和ACT(β-actin);对所有种子样本而言,PP2Acs(a catalytic subunit of protein phosphatase 2A)是最稳定的内参基因。研究结果将为刺萼龙葵种子休眠萌发的遗传调控研究提供重要参考。     

利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性

β-甘露聚糖酶是种子萌发过程中降解胚乳细胞壁的关键酶,明确其活性的动态变化可为揭示杂草种子的休眠萌发机制提供重要依据。以外来杂草刺萼龙葵Solanum rostratum Dunal种子为材料,建立了种子中β-甘露聚糖酶活性的检测方法—凝胶扩散法。利用凝胶扩散法对不同贮存时间及贮存条件下刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性进行了检测,发现贮存3年以上的种子中该酶的活性为0.03 nmol/(min·mg),显著低于贮存3年以下的种子中的酶活性0.15 nmol/(min·mg),而湿润冷藏的种子中β-甘露聚糖酶的活性为0.12 nmol/(min·mg),显著高于干燥冷藏的种子的酶活性0.02 nmol/(min·mg)。实际应用结果表明,凝胶扩散法综合了传统方法的优势,检测特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量种子样品,具有良好的实用性。     

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的检测技术及脱毒方法研究进展

为了弄清目前建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)病毒检测和脱毒的研究概况,本研究详细阐述了2种病毒的检测方法、采用的脱毒技术和脱毒效率,分析比较了不同技术存在的弊端,指出现有的脱毒方法已不能满足兰科植物脱毒研究的需要。在此基础上,进一步提出应采用安全、可靠的新型脱毒技术来解决目前兰科植物产业瓶颈问题。超低温脱毒技术是近年来发展迅速的脱毒技术,具有独特优势,目前已在多种植物上成功应用,该方法的应用有望解决2种病毒脱毒方面存在的问题。     

Control of lettuce big-vein disease by application of fungicides and crop covers

One of the economically important diseases of lettuce is lettuce big-vein disease (LBVD), which leads to severe yield losses. LBVD is associated with a complex of two viruses, Lettuce big-vein associated virus (LBVaV) and Mirafiori lettuce big-vein virus (MLBVV). These viruses are transmitted by motile zoospores of Olpidium spp. fungi, which persist in the soil for decades through resting spores. In greenhouse and field experiments, this study tested whether changing plant and soil temperatures together with fungicide application would have a significant effect on controlling LBVD in lettuce. Soil fumigation with metam sodium was not effective at controlling the disease, as opposed to treatment with chloropicrin and methyl bromide. Moreover, the fungicides carbendazim and fluazinam were effective in reducing the incidence of Olpidium virulentus. Nevertheless, control of the fungal vector did not seem to be sufficient to control the disease due to the transition ability of the virus under low vector abundance. Crop covers, which affect the favourable environmental conditions for the viruses by lowering soil temperature and raising air temperature, reduced the disease symptoms. Combining fungicides with crop cover had a synergistic effect on reducing disease symptoms, thus providing a sustainable solution for LBVD.     

豫南茶树种质资源籽实脂肪含量及脂肪酸组成分析

以豫南地区42份茶树种质资源的茶籽为研究对象,分析了茶籽含仁率及茶籽仁的脂肪含量,范围分别在33.53%~71.60%、17.77%~38.39%。利用气-质联用技术（GC-MS）检测了茶籽仁中的脂肪酸组成和含量,共检测到21种脂肪酸,其中主要成分棕榈酸、硬脂酸、顺-油酸、亚油酸和α-亚麻酸的含量分别在2.64%~5.70%、0.21%~1.11%、7.33%~17.29%、0.09%~8.44%和0.01%~0.15%;相关性分析显示,顺-油酸与十三碳酸、十四碳酸和顺-二十碳二烯酸的含量呈极显著负相关,亚油酸与反-油酸、顺-二十二碳六烯酸含量呈极显著负相关;除了水仙7202茶籽仁中的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量比值为3.08∶12.16∶1,其余茶树种质资源茶籽仁中,这三类脂肪酸的比值均约为1∶2.69∶1.37。中黄1号、农抗早、迎霜、鄂茶11号、龙井43、中选8号、崂山3号和黄金叶8个茶树品种,不仅含仁率和脂肪含量较高,而且茶籽仁脂肪酸的组分和含量丰富、均衡,可初步筛选出来作为豫南地区叶籽两用茶园的候选品种。     

美国马铃薯种薯生产及认证

美国是世界上马铃薯生产最先进的国家之一。在对美国种薯生产进行实地考察和查阅相关文献的基础上,介绍了美国马铃薯种薯生产概况、种薯质量检测、种薯认证方式和认证程序等,并对种薯分级、田间检测、收获后检测标准和检测参数、病害允许率等进行了详细阐述。美国的种薯生产和认证的经验,可为中国发展马铃薯种薯生产与认证提供借鉴与参考。     

杂交稻低播量精量播种育秧及机插取秧特性

【目的】明确杂交稻70 g以下低播量精量穴播和条播对育秧效果及机插特性的影响,突破生产中杂交稻机插的技术瓶颈。【方法】以中浙优1号和甬优1540两个杂交稻品种为材料,利用机插标准9寸盘,设置机械穴播和条播两个精量播种方式,并以机械流水线撒播为对照,穴播规格为16(纵向)×34(横向)穴,条播为纵向16条,以穴播5粒、3粒及2粒的播种量进行播种试验。考查了低播量下不同播种方式对秧苗生长影响及配套取秧效果【结果】1)低播量下不同播种方式对秧苗成苗率的影响不大。2)降低播种量提高秧苗生长一致性,且穴播和条播秧苗生长一致性好于撒播。3)与撒播相比,精量穴播和条播能够在低播量下提高秧苗根系盘结力和成毯性,中浙优1号和甬优1540根系盘结力比撒播平均高75.4%和81.0%,播量每穴3粒时即能有效成毯,穴播和条播差异不大。4)精量穴播和条播能够显著降低低播量下机插漏秧率,中浙优1号和甬优1540机插漏秧率平均分别比撒播低76.3%和74.6%,穴播和条播下,两个品种每穴播量3粒的漏秧率均在1%以下,与撒播相比降幅在10个百分点以上。5)精量穴播和条播机插取秧苗数均匀度比撒播要好,两个品种预期取秧2~5苗(5粒)、1~3苗(3粒)和1~2苗(2粒)比例均达80%以上,中浙优1号和甬优1540机插苗数均匀度平均比撒播高121.2%和67.0%,其中,穴播机插取秧苗数均匀度及预期取秧苗数比例高于条播。【结论】精量穴播和条播可以解决目前杂交稻机插用种量大、漏秧率高和机插取秧苗数均匀度差的问题。     

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】 筛选不同温度下烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染后枯斑三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）差异表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】 N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline,PBS）,48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90（N. tabacum var. TN90）基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）,并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】 4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8 000万条clean reads,共获得4 737条已知lncRNA、40 169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】 不同温度（25℃和31℃）条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。